引言
本标准是为规范抗菌制品抗菌性能的评价方法制定的，并于1998年12月在“生活相关新型（抗菌）功能制品会议”的报告上公布的，（亦称“抗菌制品的指导方针”）。本标准规定了作为抗菌制品重要性能之一的抗菌性能的测试方法。抗菌制品的其他重要性能，包括安全性、性能持久以及制品标识则请参考“抗菌制品的指导方针”。

1. 范围
本标准规定了抗菌制品（包括中间制品）表面抗细菌活性及效果的测试方法。
备注：本标准暂不包括抗菌制品的其他功能，如抗真菌性能和除臭性能。

2. 规范性引用标准
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是不注日期的引用文件，其新版本适用于本标准。
JIS K 0950 灭菌塑料培养皿
JIS K 0970 微量移液器
JIS K 3800 二级生物安全柜
JIS K 8101 乙醇（99.5）
JIS K 8150 氯化钠
JIS K 8180 盐酸
JIS K 8263 琼脂
JIS K 8576 氢氧化钠
JIS K 9007 磷酸二氢钾
JIS K 9017 磷酸氢二钾
JIS L 1902 纺织品抗菌性能的检测与评价
JIS R 3505 玻璃量具

3. 定义
本标准中用到的主要术语定义如下：
a）抗菌 抑制制品表面细菌生长的状态。
b）抗菌整理 为获得抗菌效果而进行的处理。
c）抗菌制品 实施抗菌加工后的制品。
d）抗菌活性值 抗菌制品和未处理制品在接种细菌培养后，得到活菌数目对数的差值。
参考资料：JIS L 1902的抑菌（静菌）活性和本标准中的抗菌活性概念相同。
e）抗菌效果 根据抗菌活性值判定抗菌制品抗菌效果。

4.抗菌效果
按本标准的测试方法，抗菌制品的抗菌活性值应不小于2.0，超过2.0的数值若取得各相关单位同意也可采用。

5.试验方法
5.1 纺织制品测试方法  抗菌纺织制品的检测方法根据JIS L 1902 : 8（定量法）测定
5.2 塑料等制品的测试方法  适用于非纺织制品，如塑料制品、金属制品、陶瓷制品等。根据纤维制品的形状和用途也可采用5.1 的方法测试。
5.2.1 试验菌种
试验所采用的菌种见下，需采用下述细菌中的每一种：
a) 金黄色葡萄球菌
b) 大肠杆菌
试验所用菌株举例如表1所示。如从有别于表1的机构获取菌株，则该机构必须是国际菌种保藏中心（WFCC: World Federation of Culture Collection）的成员或日本菌种保藏协会（JSCC：Japan  Society of Culture Collection）的成员，并且菌株必须和表1相同。
表1 试验所用的菌株

5.2.2 化学试剂、材料和器材
除非另有说明，本试验方法所用的化学试剂、材料和器材如下所示。
乙醇（C2H5OH）   符合JIS K 8012规定的一级或更高
牛肉膏           微生物试验用
蛋白胨           微生物试验用
氯化钠           符合JIS K 8150
纯化水           符合日本药典第十三次修订版要求
琼脂             符合JIS K 8263
酵母浸膏         微生物试验用
胰蛋白胨         微生物试验用
葡萄糖           微生物试验用
酪蛋白胨         微生物试验用
大豆蛋白胨       微生物试验用
卵磷脂           微生物试验用
非离子表面活性剂 聚山梨醇脂（吐温80）
磷酸二氢钾       符合JIS K 9007
磷酸氢二钾       符合JIS K 9017
氢氧化钠         符合JIS K 8576
盐酸             符合JIS K 8180
棉塞等           棉制，或硅胶、金属、莫顿塞等
白金接种环       端部直径约为4mm环
干热灭菌器       可在160-180℃工作
蒸气消毒锅       可保持121℃并在103KMPa保压
安全柜           符合JIS K 3800的规定
洁净台           微生物试验用
移液管           符合或等同于JIS K 0970 或达到JIS R 3505中规定的A级
培养箱           温度控制精度±1℃
培养皿           玻璃材质，内直径90mm或遵照JIS K 0950中90A或90B规定
洗脱袋           微生物试验用
Stomacher         微生物试验用
薄膜             不影响微生物生长并且不吸水的材料，厚度无明确规定，但要求附着性好

5.2.3 灭菌方法
a) 干热灭菌   放入干热灭菌器在160-180℃下灭菌30-60分钟
注意：灭菌后，如果棉塞或包装纸不小心被水弄湿，相关器皿请不要继续使用。
b) 高压蒸汽灭菌  在灭菌消毒锅中注入水，将待灭菌的物品装入筐中，并放于消毒锅架子上，盖紧，加热，在121℃或103Kpa下保持15-20分钟。停止加热，然后使其自然冷却到100℃以下，打开排气阀放出蒸汽，打开盖，取出灭菌物品。必要时放入洁净台或安全柜中冷却。为避免灭菌锅受培养物质或化学品污染，用中性洗涤剂洗涤灭菌锅，并用水冲洗干净。
c) 火焰灭菌 将待灭菌的物品置于由燃气或酒精燃烧而产生的火焰上，如对于白金接种环应加至红热，对于试管则在火焰上烤2-3秒钟。
d) 器材准备 用碱性或中性洗涤剂洗刷试管、烧瓶等器具，充分冲洗，干燥后干热灭菌或蒸汽灭菌后使用。

5.2.4 培养基等
使用下列培养基，如商品培养基和此处介绍的培养基组成相同，则也可使用商品培养基。
a）营养肉汤  将3.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨、5.0g氯化钠溶于1000ml蒸馏水或去离子水中，放入锥瓶、混合、充分溶解后，用盐酸或氢氧化钠溶液调节其pH为7.0-7.2（25℃），使用前，将其分别注入试管，加上棉塞，然后进行高压灭菌。
若配好后不立即使用，要在5℃～10℃下保存。不要使用配制完存放一个月或以上的培养基。
b）营养琼脂  将5.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨、5.0g氯化钠和15.0g琼脂，加入1000ml蒸馏水或去离子水中，置入锥瓶、混合并放入沸水浴中充分溶解。用盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节其pH为7.0-7.2（25℃），加上棉塞，然后进行高压灭菌。
若配好后不立即使用，要在5℃～10℃下保存。不要使用配制完存放一个月或以上的培养基。
c）平板计数琼脂  将2.5g酵母粉、5.0g胰蛋白胨、1.0g葡萄糖和15g琼脂加入到1000ml蒸馏水或去离子水中，置于锥瓶中混合并在沸水浴中充分溶解。然后用盐酸或氢氧化钠溶液调节pH为7.0-7.2（25℃），加上棉塞，然后进行高压灭菌。
若配好后不立即使用，要在5℃～10℃下保存。不要使用配制完存放一个月或以上的培养基。
d）斜面培养基  将6-10ml加热溶解的营养琼脂b)注入试管，塞上棉塞并用高压蒸汽法灭菌。灭菌后的试管在洁净间中以和水平面成15°倾角放置来让其凝固。若配好后不立即使用，要在5℃～10℃下保存。如没有冷凝水出现，将其溶解，并凝固后使用。不要使用配制完存放一个月或以上的斜面培养基。
e）SCDLP肉汤  将17.0g酪蛋白胨、3.0g大豆蛋白胨、5.0g氯化钠和2.5g磷酸氢二钠、2.5g葡萄糖和1.0g卵磷脂加入到1000ml蒸馏水或去离子水中，置于烧瓶，加7.0g非离子表面活性剂以促进溶解。用盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节其pH为6.8-7.2（25℃）.使用此培养基时，将其分散到试管中或烧瓶中，将棉塞塞上，然后用高压湿热法灭菌。
若配好后不立即使用，要在5℃～10℃下保存。不要使用配制完存放一个月或以上的SCDLP肉汤。
f）磷酸盐缓冲溶液  将34.0g磷酸二氢钾放入容量瓶中，加入500ml蒸馏水或去离子水已将其充分溶解，用氢氧化钠溶液调节其pH为6.8-7.2(25℃),然后加入蒸馏水或去离子水将溶液定容到1000ml。使用时，取部分溶液到试管或烧瓶中，塞上棉塞，并加入7.0g非离子表面活性剂。用盐酸或氢氧化钠溶液调节其pH为6.8-7.2（25℃）。使用此溶液时，将其分装至试管或烧瓶中，塞上棉塞，然后用高压湿热法灭菌。
若配好后不立即使用，要在5℃～10℃下保存。不要使用配制完存放一个月或以上的磷酸盐缓冲溶液。
g）磷酸盐缓冲生理盐水溶液
用浓度为0.85%的氯化钠溶液稀释磷酸盐缓冲溶液至体积比800倍。当使用此溶液时将其分装至试管或烧瓶中，塞上棉塞，然后用高压湿热法灭菌。若配好后不立即使用，要在5℃～10℃下保存。不要使用配制完存放一个月或以上的磷酸盐缓冲生理盐水溶液。

5.2.5 细菌的保藏 在无菌条件下转接试验细菌，必要时要使用生物安全柜。一手同时拿着保藏菌和5.2.4 d)的待接种斜面培养基，另一手拿接种环，并用拿接种环的手拔开试管的橡胶塞。在火焰上对试管口灭菌，并对接种环灭菌，然后将接种环的头部放入斜面培养基的冷凝水中冷却。用接种环从细菌生长面上刮下细菌，并用划线法接种到斜面培养基上。用火焰再次对试管口部进行消毒并塞上棉塞。用火焰对接种环进行消毒。在35±1℃下对接种后的斜面进行24-48小时培养，然后在5-10℃保藏。一个月内将其接种到新的斜面（以此类推），但接种次数从菌种中心得到的细菌算起不应超过10代。如保存时间达到或超过一个月，不可进行继代培养。

备注：如图1将接种环端部插入冷凝水中分散细菌，用接种环从底部拉一条线到上部，或将接种环再次插入到冷凝水中画一条折线到顶端。
注意：如细菌保藏机关提供的细菌经过冻干法或冷冻法用于长时间保存，从原始保存菌制备保藏细菌的次数也应包括在细菌培养代数之内。
如使用此保藏菌株，则其继代培养次数不应超过10减去保藏菌的代数。

5.2.6 试验操作 细菌操作必须在无菌条件下进行，试验菌注意不能对试验操作人员、设备和环境构成污染，如有需要则使用生物安全柜。
a）细菌前培养 用接种环从5.2.5的保藏细菌的培养基中取1环细菌接种到5.2. 4 d)的斜面培养基上，35±1℃条件下培养16-24小时。从这一培养物上，再取一环细菌到新的斜面培养基上，35±1℃条件下培养16-20小时。
b）样片准备 从制品上切取边长为50±2mm，厚度不大于10mm[3]的方块，作为标准样片。空白对照样[4]6块[5]、抗菌样片3块。如不能得到空白对照样，则利用5.2.2的薄膜。密切注意样片和样片制备过程中的微生物污染以及制品的污物污染。尽量从制品上采集样片，如由于制品的形状的原因不能从制品采集样片，则利用相同的原料和工艺单独制备样片。
备注：
[3]如难以或不能将制品切成50±2mm，厚度不大于10mm的方块，也可采用非标准形状和尺寸的样片，这一样片应该可以在其上覆盖400-1600mm2的薄膜。
[4]从空白样或薄膜制得的样片。
[5]6个未抗菌处理样片中，3个用于接种后零时间记数，另外3个用于接种后培养24小时后记数。
c）样片清洗 用纱布或脱脂棉蘸酒精轻轻擦拭b)中样片2-3次，并干燥彻底。若上述处理会导致样片软化、样片表面涂层溶解及组分溶出等现象，则认为此种处理将影响试验结果，可采用其他方法处理或直接试验而不进行任何处理。
d）接种菌液的制备  将5.2.4 a）的营养肉汤稀释500倍，用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH至6.8-7.2,然后高压灭菌，作为1/500NB。将a)中的前培养物取1环均匀分散到少量的1/500NB中，采用显微镜观察法或其它合适的方法估计细菌数目，并用1/500NB稀释菌液至细菌浓度为(2.5～10)×105cfu/ml,以此作为试验用菌液。若菌液不立即使用，将其冷冻至0℃，保存时间不超过4小时。
e）试验菌液的接种 将c)中的样片放入灭菌培养皿中，保持试验面朝上[6] ，用移液管[7] 准确量取d）中的菌液0.4ml,缓慢滴到每个样片表面。并将薄膜盖于菌液上，调节薄膜使菌液分散到整个薄膜，注意不要使菌液从薄膜边溢出，然后盖上培养皿的上盖。
备注：
[6] 试验面必须为制品的抗菌加工面，即使抗菌加工达到制品的一定深度，也不能采用制品的横切面。
[7] 若采用标准尺寸以外的样片，则所加菌液量根据该样片所用薄膜的尺寸按比例减少。即使对于符合标准尺寸的样片，如按规定量接种时，由于某些材料如陶瓷、玻璃、瓷砖、搪瓷等的亲水性好，难免因培养皿稍微倾斜而导致培养液流出。此种情况下，接种菌液量减为规定菌液量的1/4。但即使菌液量减少也要保证每片上的细菌数为（1.0-4.0）×105cfu/ml，此种情况下，d)中规定的菌液浓度不能满足要求，而必须根据具体要求配制。
[8]薄膜的标准尺寸为40±2mm。若样片为非标准尺寸，则调整薄膜尺寸，以使薄膜边缘距样片边缘2.5mm以上，但薄膜尺寸不应小于400mm2。在制品由于形状难以将薄膜密着于样片表面，以及由于表面吸水或亲水，不使用薄膜菌液也可在样片表面铺展这二种情况下可不用薄膜。
f）接种后样片的培养 将接种后放置3个抗菌样片和3个空白无加工样片的培养皿，在35±1℃相对湿度不小于90%的条件下培养24小时。
参考资料：此时制品的抗菌性能是在该培养温度下的抗菌活性值，但也可同时考虑抗菌材料的使用温度（如室温）下的抗菌性能。
g）培养后样片的洗脱
1）0接触时间的样片的洗脱[9] 对3个0接触时间的空白对照样，将覆盖膜和样片用镊子小心放入Stomacher袋以防止菌液损失，用移液管取5.2.4 e)中10ml SCDLP加入到Stomacher袋中，并用手或分离器充分搓揉样片和薄膜。洗脱后马上对洗脱液进行活菌计数。
2）培养后试验片的洗脱[9]   对f）中的培养后样片的洗脱采用类似1）的方法进行，之后马上对洗脱液进行活菌计数。
[9] 对于细菌洗脱，如有其他方法效果与此种方法相当或优于此方法，也可采用。如因为样片尺寸以及其他性能方面的原因，用10ml SCDLP难以洗脱，也可增加SCDLP用量。
h）倾注活菌计数法 用移液管准确量取g)的洗脱液1ml，放于装有9.0ml 5.2.4  g)中的磷酸盐生理盐水缓冲液的试管中，充分混匀。用新的移液管从中量取1ml到另一支试管中并混匀。重复上述10倍梯度稀释过程。从洗脱液及其稀释液中分别取1ml，各放入2个灭菌培养皿中，向各培养皿中倾入15-20ml温度为46-48℃的5.2.4 c)中的平板计数琼脂，与菌液混和充分。盖上上盖，允许在室温放置。待琼脂凝固后将培养皿翻转，并在35±1℃培养40-48小时。培养后，计算菌落数为30-300的培养皿，若1ml洗脱液中的细菌数小于30，则对该培养皿直接计数。如任何培养皿中均没有菌落，则记录为＜1。如果细菌数和稀释比例不成反比，则要考虑由于抗菌剂的作用而影响了菌落的形成，这样就需要使用中和剂或稀释等方法使抗菌剂不对菌落形成产生影响的方法来培养计数。
参考资料：本规定以外采集的菌落数的计算方法，可参考日本药学会编的卫生试验法注解（2000）1.2微生物试验法3）菌数测定（1）倾注平板试验法，或卫生福利部生活卫生局监制修订的食品安全规则的2有害指示菌1.标准分析方法中的总菌数测定。

5.2.7  活菌数计算
根据式（1），由菌落计数的得到活菌数。
N=C×D×V                                                           （1）
其中  N:每样片的活菌数
C:菌落数（2个培养皿的平均值）
D:稀释倍数
V：用于洗脱的SCDLP培养液的体积(ml)
记录活菌数时取二位有效数字，第三位有效数字四舍五入。在V=10的情况下，对菌落数小于1的情况记为小于10。取活菌数的平均值时，对三个试验片的活菌数取算术平均值，结果保留二位有效数字，第三位有效数字四舍五入。当活菌数为小于10时，此数作为10 进行平均值计算。

5.2.8 试验结果
a）试验成立条件的判定  当下述三个条件都得到满足时，试验被判定有效。反之，则试验无效，须重新进行试验。

1. 空白对照样片零接触时间的活菌数满足如下条件：

（L最大- L最小）/ L平均≤0.2
其中：L最大—活菌数的最大对数值
L最大—活菌数的最小对数值
L平均—三个样片的活菌数对数的平均值

1. 零接触时间空白对照样的活菌平均值应为(1.0-4.0)×105个。

2. 三个空白对照样经24小时培养后的活菌数均不能小于1.0×103个。当空白对照样上覆盖薄膜时，三个样品培养后的活菌数均不能小于1.0×104个。

b）抗菌活性值计算  试验成立条件下，根据式（2）计算抗菌活性值，保留小数点后一位有效数字，对小数点后的第二位有效数字四舍五入。
R=[log(B/A)- log(C/A)]=  [log(B/C)]                                        (2)
其中： R-抗菌活性值

1. 空白对照样0接触时间活菌数平均值

2. 空白对照样24小时培养后活菌数平均值

3. 抗菌加工样片24小时培养后活菌数平均值

6  试验结果记录
6.1 纺织制品  记录试验细菌种类、细菌保藏号、接种菌液浓度（接种菌液中所含的细菌数）、抗菌活性（抑菌活性）、样片种类等。如在接种液中加入了非离子表面活性剂，则须记录其名称和浓度。
6.2 塑料制品  记录空白对照和抗菌处理样片的种类、尺寸、形状、厚度、薄膜厚度、细菌种类、保藏号、接种用菌液的体积、试验菌液中的活菌数、5.2.8中的A、B、C值以及抗菌活性值等。